滿滿的干貨（三）：質(zhì)粒DNA的提取，困難解決了嗎？

綜合前兩期的“滿滿的干貨（一）"和“滿滿的干貨（二）"，大家對(duì)于質(zhì)粒DNA的提取應(yīng)該會(huì)有一定程度的了解，那么在使用過程中，很多人覺得自己提取的質(zhì)粒效果還是很差，究竟是怎么回事呢？

本期給大家在準(zhǔn)備了一些質(zhì)粒DNA提取時(shí)需要注意的事項(xiàng)，這些結(jié)果包含了濃度偏高或低的原因及解決方案：

原因及解決方案

01質(zhì)粒濃度偏高

存在RNA殘留：未充分消化RNA（RNase A失效或未添加），導(dǎo)致A260值虛高。

解決方案

提取前一定要在溶液Ⅰ中加入RNase A，如果已加完RNase A的溶液Ⅰ在冰箱放置久了，一定要補(bǔ)加RNase A。

02細(xì)菌培養(yǎng)狀態(tài)不佳

• 細(xì)菌密度過低：若細(xì)菌培養(yǎng)液OD值（如OD600）未達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期（通常1.0-1.5），菌體數(shù)量不足，會(huì)直接導(dǎo)致質(zhì)粒總量減少。

• 培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)：超過對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，細(xì)菌進(jìn)入穩(wěn)定期或衰退期，可能釋放核酸酶降解質(zhì)粒，同時(shí)菌體裂解難度增加。

• 細(xì)菌污染，若培養(yǎng)液中混入雜菌，雜菌會(huì)爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)，導(dǎo)致目標(biāo)細(xì)菌生長(zhǎng)受抑，同時(shí)可能釋放酶類破壞質(zhì)粒。

• 菌液長(zhǎng)期存放。

解決方案

（1）調(diào)整培養(yǎng)時(shí)間至12-16小時(shí)，但避免過度生長(zhǎng)導(dǎo)致質(zhì)粒丟失。

（2）確保使用合適的培養(yǎng)基（如LB）和正確的抗生素濃度。

（3）接種前用新鮮活化的單菌落，避免使用陳舊或多次傳代的菌液。

03質(zhì)粒拷貝數(shù)低

• 某些質(zhì)粒（如大質(zhì)粒或低拷貝質(zhì)粒）天然拷貝數(shù)低（如pBR322為低拷貝）。

• 插入片段過大（>10kb）導(dǎo)致復(fù)制效率下降。

解決方案

（1）選擇高拷貝質(zhì)粒載體。

（2）若需保留低拷貝質(zhì)粒，可增加培養(yǎng)體積（如從5mL增至10-20mL），提高質(zhì)粒總量。

04質(zhì)粒降解

在提取過程中，如果操作環(huán)境存在核酸酶（如DNase、RNase），或者提取過程中劇烈震蕩、溫度變化過大等，可能會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒降解，使提取的質(zhì)粒濃度降低。

解決方案

（1）在提取過程中，使用無核酸酶的試劑和耗材，如無核酸酶的水、無核酸酶的離心管等。

（2）操作時(shí)動(dòng)作要輕柔，避免劇烈震蕩。嚴(yán)格控制溫度，尤其是在裂解和洗脫等關(guān)鍵步驟。

原因及解決方案

05裂解不充分

菌液量過多。

堿裂解（Solution II）時(shí)間過短：無法充分破壞細(xì)菌細(xì)胞膜和釋放質(zhì)粒；時(shí)間過長(zhǎng)（超過5分鐘）：會(huì)導(dǎo)致基因組DNA斷裂并與質(zhì)粒共沉淀，同時(shí)強(qiáng)堿可能降解質(zhì)粒。

裂解液未混勻。

解決方案

（1）采用適量的菌液量進(jìn)行提取。

（2）確保充分裂解，但時(shí)間不要超過5分鐘。

（3）加完Solution II一定要輕柔且充分混勻。

06中和與離心不充分

• Solution III未充分混勻，質(zhì)粒復(fù)性不充分；

• 離心轉(zhuǎn)速/時(shí)間不足（如<12,000rpm或<10分鐘），沉淀未分離。

解決方案

（1）加入Solution III后，立即顛倒混勻8-10次，直至出現(xiàn)均勻白色絮狀沉淀。

（2）12,000-13,000rpm離心10-15分鐘，確保充分沉淀。

07洗脫液使用不當(dāng)

• 洗脫液體積過大。

• 洗脫液pH不合適。

• 洗脫溫度不足：未將洗脫液預(yù)熱至60℃左右，低溫會(huì)降低質(zhì)粒從硅膠膜上的解離效率。

• 加完洗脫液未靜置直接離心。

解決方案

（1）洗脫時(shí)調(diào)整洗脫液添加體積，洗脫液體積過大會(huì)稀釋濃度；體積過小則無法充分濕潤(rùn)硅膠膜，導(dǎo)致質(zhì)粒洗脫不充分。

（2）洗脫液（ddH2O或TE緩沖液）pH偏酸性（<7.0）會(huì)降低質(zhì)粒溶解度，影響洗脫效率，建議pH8.0-8.5。

（3）洗脫液加入后需靜置1-2分鐘，質(zhì)粒充分溶解并釋放后再離心。

08操作損耗

• 離心后上清未充分吸棄，稀釋菌體。

• 重懸緩沖液（Solution I）未充分混勻，菌體沉淀未分散。

解決方案

（1）菌體離心后，用移液器充分吸盡上清（殘留量<10μL）。

（2）加入Solution I后，用渦旋儀或移液器反復(fù)吹打至沉淀充分分散（無可見顆粒）。

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