丙酸蛛網(wǎng)菌探針法熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒

注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

儲(chǔ)存條件：

14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

探針法：
丙酸蛛網(wǎng)菌探針法熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒aqMan 探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴(kuò)增相關(guān)。它與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對(duì)。熒光基團(tuán)連接在探針的5’ 末端，而淬滅劑則在3’ 末端。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對(duì)時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’ 端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的5’ 外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累。因此熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。相對(duì)于染料法,Taqman探針法具有更高的特異性和準(zhǔn)確性。
使用方法：
一、樣品DNA的制備
用自選方法提取細(xì)菌樣品DNA。注意：DNA純化方法是決定檢測(cè)靈敏度的關(guān)鍵因素。如果不能很好純化樣品DNA，后面的PCR再靈敏也不能提高整體檢測(cè)靈敏度。
二、制備O157:H7標(biāo)準(zhǔn)曲線（以10-10E6這6個(gè)10倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體病毒做陽性對(duì)照，只提供沒有傳染性的、可以直接使用的DN段作為陽性對(duì)照。
1. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為6，5，4，3，2和1號(hào)。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL超純水（用帶芯槍頭，下同）。
3. 先將本試劑盒提供的陽性對(duì)照用TE緩沖液或超純水10倍梯度稀釋到10E7拷貝/μL（注：請(qǐng)不要將本試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品一次性稀釋至10E7拷貝/μL，建議每次稀釋10倍，梯度稀釋至10E7拷貝/μL）。
4. 在6號(hào)管中加入5 μL 10E7拷貝/μL的O157:H7陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照。
5. 換槍頭，從6號(hào)管中取5 μL溶液到5號(hào)管中，充分震蕩1分鐘，得10E5拷貝/μL的陽性對(duì)照。
6. 換槍頭，從5號(hào)管中取5 μL溶液到4號(hào)管中，重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。
7. NC管中不加任何陽性對(duì)照。
8. 從1-6號(hào)管中分別取5 μL和待測(cè)樣品一起進(jìn)行定量PCR（見下步），每個(gè)樣品做3次重復(fù)。PCR后得到每個(gè)陽性對(duì)照稀釋樣品的熒光PCR Ct值，并以之為縱軸，以濃度的對(duì)數(shù)值為橫軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖：

應(yīng)用案例：
樣品 DNA 的制備
1.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼 容。。也可以選購(gòu)本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級(jí)版柱式病毒 DNAout。 本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送 15 次 DNA 病毒裂解液試用裝（一管式病毒 DNAout 的成分）。
稀釋陽性對(duì)照（以 10E2-10E7 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供可以直接使用的長(zhǎng)為 86bp 的 DN段作為陽性對(duì)照。
2.標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4.在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。5.換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。
6.換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照到 5 號(hào)管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。
7.換槍頭，在 4 號(hào)管中加 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照到 4 號(hào)管中，得1×10E4 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用
8.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20  μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9.在 PCR 管中加入下列成分。
以下是公司正在銷售的產(chǎn)品：

二二醇標(biāo)準(zhǔn)品人α谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(α-GST)ELISA Kit，48T/96T

酞酸二酯標(biāo)準(zhǔn)品小鼠α谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(α-GST)ELISA Kit，48T/96T

安非拉酮鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品大鼠α谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(α-GST)ELISA Kit，48T/96T

癸二酸二酯標(biāo)準(zhǔn)品犬葉酸(FA)ELISA Kit，48T/96T

己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品人葉酸(FA)ELISA Kit，48T/96T

避蚊胺標(biāo)準(zhǔn)品小鼠葉酸(FA)ELISA Kit，48T/96T

醋酸雙氟拉松標(biāo)準(zhǔn)品大鼠葉酸(FA)ELISA Kit，48T/96T

二氟尼柳標(biāo)準(zhǔn)品人血小板反應(yīng)蛋白/凝血酶敏感蛋白1(TSP-1)ELISA Kit，48T/96T

洋地黃標(biāo)準(zhǔn)品小鼠血小板反應(yīng)蛋白/凝血酶敏感蛋白1(TSP-1)ELISA Kit，48T/96T

丙酸蛛網(wǎng)菌探針法熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒洋地黃甙標(biāo)準(zhǔn)品大鼠血小板反應(yīng)蛋白/凝血酶敏感蛋白1(TSP-1)ELISA Kit，48T/96T

二辣椒堿標(biāo)準(zhǔn)品人游離脂肪酸(FFA)ELISA Kit，48T/96T

酒石酸雙可待標(biāo)準(zhǔn)品小鼠游離脂肪酸(FFA)ELISA Kit，48T/96T

17- 雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品大鼠游離脂肪酸(FFA)ELISA Kit，48T/96T

磺酸二麥角標(biāo)準(zhǔn)品人EJ抗體/抗甘氨酰tRNA合成酶抗體(EJ/GlyRS)ELISA Kit，48T/96T

雙鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品人血小板膜糖蛋白ⅡbⅢa(GP-ⅡbⅢa)ELISA Kit，48T/96T G protein alpha Inhibitor 2  G蛋白α抑制蛋白2抗體鹽酸雷尼替

G Protein alpha Inhibitor 1  G蛋白α抑制蛋白1抗體鹽酸哌唑嗪

G protein alpha  G蛋白α抗體鹽酸胺醇

G alpha gust  Gα gust抗體鹽酸異腎上腺素

FXYD1  酸神經(jīng)膜抗體鹽酸左旋咪唑

FXR2  脆性X相關(guān)蛋白2抗體鹽酸奈福泮

FXR1  脆性X相關(guān)蛋白1抗體重酒石酸去腎上腺素

Fx1A  腎刷狀緣抗體醋酸地孕酮

FUT8  巖藻糖轉(zhuǎn)移酶8抗體睪酮   

FUT1  巖藻糖轉(zhuǎn)移酶1抗體布美他尼

Fumarate hydratase/FH  富馬酸水合酶抗體氨環(huán)酸

FUCA1/Alpha L fucosidase I  α-L巖藻糖苷酶抗體胡椒腈

FTO/Protein fatso  脂肪堆積和肥胖相關(guān)蛋白抗體谷胺

FSTL5  卵泡抑素相關(guān)蛋白5抗體吡羅昔康

FSTL1/FRP  卵泡相關(guān)蛋白1吡嗪酰胺